Annexe E - Les examens virologiques en pratique médicale

But : le diagnostic des infections virales, le suivi du traitement, le contrôle de la prévention.

E.1 Diagnostic des infections virales

E.1.1 Deux approches

Revoir l’illustration II-8 « Les 4 points du diagnostic virologique médical ».

Le diagnostic virologique repose, comme le diagnostic bactériologique, sur deux approches : le diagnostic direct, décelant dans les produits biologiques la présence du virus ou de ses composants, antigènes ou génomes viraux, et le diagnostic indirect, décelant l’apparition dans le sang d’une réponse immunitaire sous forme d’anticorps spécifiques du virus. Ces deux approches ne s’excluent pas et sont parfois complémentaires.

Indiquons d’emblée que recherche d’antigènes et recherche d’anticorps utilisent des réactions antigène-anticorps au mécanisme identique, la différence venant de l’origine des composants de la réaction. Dans le diagnostic direct, on recherche, à l’aide d’anticorps antiviraux de référence connus (souvent monoclonaux), contenus dans la trousse de réactifs (kit), la présence éventuelle dans les produits biologiques d’antigènes viraux correspondants. En revanche, dans le diagnostic indirect, on recherche, à l’aide d’antigènes viraux de référence connus, contenus dans la trousse de réactifs, la présence éventuelle dans le sang d’anticorps anti-viraux correspondants.

E.1.2 Diagnostic direct

Diverses techniques sont utillisables. Certaines illustrations correspondantes peuvent être vues en consultant à la bibliothèque de la faculté le « Traité de virologie médicale » EMSTEM - Deboeck 2003.

E.1.2.1 Microscopie électronique

Elle recherche des particules virales ; elles ne sont décelables qu’en concentration suffisante dans les prélèvements examinés (10⁶ par mL), seuil rarement atteint en dehors des diarrhées virales ou des liquides de vésicules.

E.1.2.2 Recherche de virus infectieux après inoculation de culture cellulaire in vitro

C’est une technique classique qui amplifie (multiplie) les virus (comme les cultures en bouillon ou sur gélose amplifient les bactéries) ; on parle aussi d’isolement du virus en culture cellulaire. La multiplication virale qui suppose plusieurs cycles de réplication (comme l’apparition des colonies bactériennes) demande quelques jours, voire quelques semaines. Tous les virus ne se multiplient pas en culture de cellules in vitro et il n’existe pas un type de culture polyvalent, de sorte que pour ratisser au plus large, le laboratoire doit recourir à plusieurs types de cultures.

Dans les cas les plus évidents, la multiplication virale se traduit par un effet cytopathique ou ECP. C’est le témoin visible en microscopie optique de la multiplication lytique du virus. Les cellules en cultures in vitro (qui sur le support de verre ou de plastique, apparaissent normalement plates, confluentes, peu réfringentes) s’arrondissent, deviennent réfringentes et se détachent du support dans le milieu de culture ; certains virus induisent l’apparition de syncytiums par fusion de la membrane cytoplasmique de cellules voisines, de proche en proche.

La coloration de la culture cellulaire (par exemple à l’hémalun-éosine) permet, dans certains cas, de voir des inclusions de matériel anormal. L’aspect de l’ECP est plus ou moins évocateur d’un virus ou d’une famille virale. Généralement, les virus à ARN, à multiplication cytoplasmique, donnent des inclusions cytoplasmiques, tandis que les virus à ADN, qui s’assemblent dans le noyau, donnent des inclusions nucléaires.

Lorsque l’ECP est tardif ou lorsqu’il est absent, on peut être conduit à rechercher dans des cultures apparemment normales de l’antigène viral (immuno-cytodiagnostic) ou des génomes viraux.

L’isolement en culture de cellules in vitro est parfois fastidieux, mais il garde l’avantage de produire des virus infectants, utiles pour certaines caractérisations ultérieures comme la capacité de multiplication, la détermination de la concentration inhibitrice d’un antiviral

E.1.2.3 Détection rapide d’antigène viral directement dans les produits biologiques

Ce diagnostic direct pratiqué à l’aide d’anticorps antiviraux (souvent monoclonaux) est très largement utilisé car c’est une technique rapide, évitant les aléas de la culture cellulaire in vitro, pouvant s’appliquer à des virus impossibles à cultiver.

• C’est, sur un prélèvement cellulaire (sécrétions muqueuses, frottis de lésion, sang ou biopsie), un immuno-cytodiagnostic.
  
  
  Il consiste en la recherche de matériel viral dans le cytoplasme ou le noyau (correspondant éventuellement à des inclusions), cela en immunofluorescence ou immunoperoxydase (anticorps antiviraux conjugués à un fluorochromes ou à une enzyme catalysant une réaction colorée).
• C’est, ailleurs, la détection d’antigènes solubles (indépendants de tout support cellulaire) dans les produits pathologiques liquides ou extraits liquides, selon plusieurs techniques :
  
  • technique ELISA où la réaction antigène-anticorps implique une adsorption de réactifs sur le font d’un puits en plastique, puis une réaction enzymatique colorée dans le liquide du puits (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay),
  • immunodiffusion sur bandelette de papier,
    
    
    
  • immunofiltration (« savonnette »),
  • test au latex où une suspension de particules de latex enrobées d’anticorps antiviraux est mélangé à un extrait liquide de produits biologiques ; les particules de latex vont se trouver agglutinées par l’intermédiaire de l’antigène viral correspondant, et à l’œil nu, la suspension de particules de latex, d’homogène et laiteuse, va devenir granuleuse.

E.1.2.4 Détection des génomes viraux directement dans les produits biologiques

Comme l’approche précédente, elle est applicable a priori à tous les virus, notamment à des virus difficiles ou impossibles à isoler. Elle repose sur l’hybridation par une sonde nucléique spécifique (complémentaires d’un segment d’acide nucléique viral connu) avec les acides nucléiques du virus correspondant éventuellement présents dans le produit biologique.

Cette réaction d’hybridation peut se faire directement sur les produits biologiques ou après amplification in vitro de la séquence nucléique virale, c’est-à-dire par réaction de polymérisation en chaîne ou PCR. La PCR (dont il existe diverses variantes) a révolutionné le diagnostic virologique en raison de sa sensibilité, de sa spécificité, de son automatisation.

Elle a cependant quelques inconvénients : sa sensibilité extrême expose au risque de contamination d’un échantillon à l’autre entre malades différents, tandis que sa spécificité expose au risque de méconnaître les variantes génétiques d’un virus.

Avec la technique des biopuces, on peut rechercher par hybridation les génomes d’une grande diversité de virus, en utilisant un support microscopique sur lequel ont été fixées des sondes correspondant à tous les virus (ou bactéries) éventuellement impliqués dans un syndrome clinique donné : biopuces pour infections respiratoires, neuroméningées, néonatales, fièvres hémorragiques, alerte au bioterrorisme. Il s’agit là d’une technique encore expérimentale, présentant actuellement un déficit de sensibilité par rapport aux techniques recherchant spécifiquement un agent infectieux.

E.1.3 Diagnostic indirect

Il s’agit ici de caractériser les anticorps éventuellement présents dans le sérum du sujet, anticorps spécifiques du virus ou des virus que l’on estime impliqué(s) dans le syndrome clinique

E.1.3.1 Différentes techniques

Citons, sans prétendre à l’exhaustivité :

• la réaction de neutralisation ; c’est une réaction de référence car les anticorps neutralisants sont parmi les plus spécifiques (pas ou peu de réactions croisées entre les espèces d’une même famille virale) et ils ont de plus une signification de protection. Cependant, il s’agit là d’une réaction fastidieuse puisqu’elle se pratique en culture de cellules in vitro ;
  
  
• la réaction ELISA a pour elle d’être automatisable et de permettre la recherche soit des IgG, soit des IgM spécifiques d’un virus donné ;
  
  
• la réaction d’immuno-empreinte ou Western blot est généralement utilisée comme confirmation d’une réaction de dépistage positif en ELISA. Elle analyse séparément les différents anticorps produits vis-à-vis des différents composants antigéniques d’un virus donné ;
  
  
• le test au latex où les particules, ici enrobées d’antigène viral, vont se trouver agglutinées par l’intermédiaire des anticorps viraux correspondants présents dans le sérum.

E.1.3.2 Que chercher par le diagnostic indirect ou sérodiagnostic ?

• Pour le diagnostic d’une infection actuelle, on recherche :
  
  • soit une augmentation significative du titre des anticorps à l’examen de deux sérums, le premier précoce prélevé le plus tôt possible, le deuxième tardif prélevé lors de la convalescence, tous deux examinés simultanément au cours de la même manipulation pour éviter toute erreur due à la variabilité intermanipulation.
  • soit la présence d’IgM spécifiques qui théoriquement, du fait de leur fugacité, signent, par leur seule présence, une primo-infection en cours. Ce n’est vrai que pour certaines infections virales aiguës telle que la rubéole ou l’hépatite A.
• La seule présence d’IgG spécifiques dans un sérum unique signifie trace immunitaire de l’infection mais ne permet pas de dater cette infection. En effet :
  
  • un titre élevé ne signe pas une infection récente chez un individu donné, tant est grande la variabilité individuelle de la réponse immunitaire humorale, en termes de rapidité, de niveau d’anticorps et de persistance. Le niveau des anticorps vis-à-vis d’un virus ne saurait être considéré comme une constante biologique, avec valeur normale et écart-type ;
  • cela étant, la seule présence d’IgG spécifiques dans un sérum constitue une information suffisante pour le praticien, en cas d’infection chronique telle qu’une infection par HIV (une telle personne, infectée, peut transmettre l’HIV, par rapport sexuel ou don de sang),
  • ou bien dans d’autres cas pour déterminer si le patient est protégé vis-à-vis du virus correspondant (titre d’anticorps anti-HBs ≥ 10 unités internationales par mL pour protéger vis-à-vis du virus de l’hépatite B),
  • encore que la politique actuelle en matière de vaccination contre l’hépatite B - ou contre la rubéole - soit de vacciner sans contrôle préalable de l’immunité : ce contrôle a alourdi la procédure, au point que certaines personnes ne sont pas allées jusqu’à la vaccination.

E.1.3.3 Limites du diagnostic indirect

Étant la détection d’une réponse immunitaire, il peut être faussement négatif en cas d’immunodépression ou chez l’enfant jeune du fait de son immaturité immunologique. Chez le nourrisson, les anticorps maternels transmis faussent le résultat

Le délai de mise en œuvre par l’organisme de la réponse immunitaire est généralement incompatible avec un diagnostic en temps utile pour la mise en route du traitement d’une infection aiguë, le résultat du sérodiagnostic parvenant à la convalescence.

Le sérodiagnostic peut être faussement positif du fait de réactions croisées entre les membres d’une même famille virale ou du fait que certains virus sont capables de déclencher par stimulation polyclonale B des réactions immunitaires très larges, non spécifiques, par exemple la sécrétion d’IgM rubéoliques au cours d’une infection à parvovirus B19.

Enfin, il ne renseigne que vis-à-vis du virus étudié, alors que l’isolement en culture, par exemple, est une technique plus polyvalente : bien des virus peuvent « pousser » en culture de cellules.