Annexe E - Les examens virologiques en pratique médicale

E.2 Rôle du praticien

Le choix des techniques du diagnostic direct ou du diagnostic indirect appartient au biologiste mais celui-ci a besoin d’être orienté par les renseignements cliniques fournis par le praticien et c’est à ce dernier que revient de mettre en œuvre les prélèvements nécessaires au diagnostic direct ou au diagnostic indirect.

E.2.1 Les prélèvements

Où, quand, comment, pourquoi faire ?

1. Pour le diagnostic indirect, ils sont relativement simples : c’est du sang ou du sérum, transportable à température ambiante, à raison d’un tube, ou de deux si l’on recherche une élévation significative du titre des anticorps.
2. Les prélèvements pour diagnostic direct sont plus divers et complexes. Indiquons seulement que :
   
   • en cas de lésion accessible, les prélèvements porteront à ce niveau (liquide céphalo-rachidien pour méningite, liquide de vésicule - avant toute application de topique -, frottis conjonctival pour conjonctivite, par exemple), sinon ils porteront au niveau de la porte d’entrée du virus, respiratoire (sécrétions nasopharyngées) ou digestive (selles) ou encore au niveau de la voie d’excrétion des virus (urine, selles), ou encore au niveau du sang (virémie) ;
   • pour les infections aiguës, en raison de la fugacité de la multiplication virale en pareil cas, les prélèvements sont à faire au plus tôt, sous peine d’être négatifs ;
   • pour la recherche des virus les plus fragiles par isolement en culture de cellules, il faudra transporter les prélèvements en évitant la perte de l’infectiosité du virus (l’inactivation) par la dessiccation ou la température ambiante (transport dans la glace, expression d’un éventuel écouvillon dans du milieu de transport liquide) ; la congélation à - 20°C est délétère pour la plupart des virus à enveloppe et toute congélation est à proscrire si l’on prévoit de faire un immunocytodiagnostic direct sur le prélèvement, dont les cellules doivent rester intactes.
   • les virus les plus dangereux exigent un triple emballage de sécurité des prélèvements,
   • les modalités précises des prélèvements variant en fonction du syndrome clinique et des techniques utilisables par le laboratoire, il faudra s’en remettre à des protocoles établis en concertation entre clinicien et virologiste.

E.2.2 Renseignements cliniques et interprétation des résultats

Le biologiste se doit d’interpréter ses résultats mais, comme pour le choix des techniques, ce n’est possible que si le praticien lui a fourni des renseignements cliniques succincts mais précis : motif de la demande, principaux symptômes et date de début des troubles. Ainsi, un résultat négatif de dépistage des anticorps IgG anti-HIV par ELISA est-il pleinement rassurant si le patient n’a pas pris de risque dans les trois mois précédant l’examen. En revanche, avec une prise de risque dans les jours précédents, ce résultat est tout à fait compatible avec une primo-infection en cours par HIV, qui comporte un risque élevé de contagion par rapport sexuel ou par don du sang.

Après contamination par agent infectieux, de même qu’existe une période d’incubation avant l’apparition des signes cliniques, il existe pour tout examen virologique, direct ou indirect, une fenêtre, avant sa positivation.

Ainsi, un examen aussi simple et courant qu’un dépistage des anticorps IgG anti-HIV par ELISA est strictement ininterprétable sans la connaissance de son motif et de la chronologie des événements l’ayant éventuellement motivé. On ne saurait trop insister sur ce point.

Par ailleurs, l’interprétation d’un test diagnostique doit prendre en compte les paramètres classiques de tout signal que sont sa sensibilité [probabilité que le test soit positif chez les individus ayant (ou ayant eu) l’infection recherchée], sa spécificité [probabilité que le test soit négatif chez les individus n’ayant pas (ou n’ayant pas eu) l’infection recherchée], ses valeurs prédictionnelles positive [probabilité que l’individu ait (ou ait eu) l’infection si le test est positif] et négative [probabilité que l’individu n’ait pas (ou n’ait pas eu) l’infection si le test est négatif].

E.2.3 Indication des examens virologiques en pratique médicale

• Ils sont utiles pour la personne elle-même quand il s’agit de confirmer le diagnostic d’une infection potentiellement grave (même si le traitement spécifique antiviral doit être mis en route en urgence, sans attendre le résultat des examens virologiques).
• Ils sont utiles en cas d’infection bénigne quand dans l’entourage se trouvent des personnes susceptibles de développer, elles, une infection grave (diagnostic d’une éruption ressemblant de près ou de loin à la rubéole dans l’entourage d’une femme enceinte non vaccinée et susceptible de transmettre à l’enfant à naître une rubéole congénitale ; diagnostic d’une éruption vésiculeuse pouvant être due au virus de la varicelle et du zona dans l’entourage d’un enfant immunodéprimé, susceptible de développer une varicelle maligne).
• Un diagnostic virologique rapide par un test simple peut éviter un traitement coûteux par antibiotiques, pour une méningite à entérovirus (PCR sur le LCR), pour une diarrhée à rotavirus (ELISA ou test au latex sur les selles), pour une grippe ou une infection respiratoire à virus RS (« savonnettes » spécifiques de ces virus sur les sécrétions nasales).
• Il est des indications d’intérêt collectif : épidémies (isoler des virus de la grippe, même au cours de cas bénins, sans attendre la survenue de cas mortels, est nécessaire à la préparation des vaccins), études scientifiques visant à l’amélioration des connaissances en matière de diagnostic, pronostic, physiopathologie, traitement curatif ou préventif (la publication de telles études suppose un diagnostic virologique confirmé par le laboratoire).

E.3 Quantification de la virémie, « seuil d’intervention » et « traitement anticipé » (preemptive)

Dans certains cas, la mise en évidence de l’infection virale ne suffit pas au praticien. Avec certains virus lymphotropes donnant une infection latente, il est tout à fait banal de trouver des génomes viraux dans le sang (la plupart des adultes bien portants ont de l’ordre de un génome de virus EBV par million de lymphocytes sanguins circulants). On est donc conduit, dans certaines circonstances, à quantifier le virus dans le sang, et l’une des techniques les plus performantes est la quantification du génome viral par PCR en temps réel sur le sang.

Ainsi, on détermine, chez les sujets immunodéprimés (greffés de moelle ou d’organe solide, par exemple), un seuil de virémie (un certain nombre de copies de génome EBV par mL de sang ou million de lymphocytes sanguins circulants) au-delà duquel l’EBV, latent dans l’organisme, risque fort de déclencher un lymphome malin. Ainsi, au-delà de ce seuil de virémie, on va prendre des mesures thérapeutiques pour tenter d’éviter l’apparition de ce lymphome : alléger, autant que faire se peut, le traitement anti-rejet de greffe, discuter une immunothérapie par anticorps monoclonal visant à limiter la prolifération lymphoblastique. On parle donc de « seuil d’intervention ».

Vis-à-vis du cytomégalovirus (CMV), autre virus latent, capable de déclencher une pneumonie mortelle chez ce même type de malades, le franchissement en virémie du seuil d’intervention déclenche un traitement antiviral anti-CMV, dit traitement anticipé (preemptive en anglais). Même attitude vis-à-vis des adénovirus chez les greffés de moelle.

E.4 Suivi des traitements antiviraux

1. La quantification virale est également un moyen de suivre l’effet de certains traitements antiviraux. Ainsi, on attend du traitement anti-HIV qu’il diminue la quantité de virus présent dans le sang, jusqu’à, si possible, le rendre indécelable en PCR.
   En l’absence d’une telle réponse, en cas « d’échappement au traitement », on doit revoir le traitement : chercher si le patient prend bien les médicaments prescrits (observance, à vérifier si besoin par le dosage de l’antiviral dans le sang), et si tel est le cas, rechercher l’émergence de virus résistant aux antiviraux prescrits, ce qui obligerait à modifier le traitement anti-HIV.
2. Test génotypique de résistance. Disposant de près de 20 médicaments antiviraux contre l’HIV, on détermine vis-à-vis desquels le virus du malade, par sélection de mutants, est devenu résistant, et vis-à-vis desquels il reste sensible, pour composer une 2^e ligne de traitement. On cherche donc les mutations de résistance dans les gènes codant la cible des antiviraux contre l’HIV, gène de la transcriptase inverse et gène de la protéase. La constellation de mutations de résistance indique les antiviraux auxquels l’HIV du patient est devenu résistant et ceux auxquels il reste sensible. Le séquençage de ces gènes de l’HIV est entré dans la pratique courante, grâce à des automates dont disposent dans nos pays les laboratoires de virologie médicale.
3. Test phénotypique de résistance.
   
   
   C’est la mesure de la concentration inhibitrice ou efficace 50 % (CI ou CE50) ou de la concentration inhibitrice ou efficace 90 % (CI ou CE90) d’un antiviral vis-à-vis d’un virus donné, en culture de cellules in vitro, pour déterminer si ce virus est sensible ou résistant à cet antiviral (analogie avec la CMI en bactériologie). Pour cela, on ajoute à une série de cultures de cellules in vitro, infectées par un inoculum viral fixe, des concentrations croissantes d’antiviral, puis l’on détermine, au bout de quelques jours d’incubation des cultures à 37°C, les quantités de virus produites sous ces différentes concentrations d’antiviral, et on les compare à celle produite par une culture témoin, infectée mais laissée sans antiviral. CI50 et CI90 sont les concentrations réduisant respectivement de 50 % et de 90 % la production virale par rapport au témoin. On parle de virus résistant quand ces valeurs sont « significativement augmentées » par rapport à un virus de référence normal, sensible (significativement augmentées voulant dire, non sans quelque arbitraire, x 3 ou x 5, selon les cas).
4. Que choisir ? Pour l’HIV, l’approche par test phénotypique de résistance est impraticable, vu le nombre d’antiviraux à tester, la lourdeur des manipulations de ce virus en culture de cellules in vitro, contrastant avec la relative facilité du séquençage des gènes viraux, relativement courts, impliqués dans la résistance, transcriptase inverse et protéase (régions de 700 et 300 nucléotides, respectivement). A l’inverse, pour un virus comme celui de l’herpès simplex (HSV-1 ou HSV-2), l’approche par test génotypique de résistance est plus difficile, vu la longueur des gènes de l’ADN polymérase ou de la thymidine kinase (de l’ordre de 3000 et 1000 nucléotides, respectivement), contrastant avec la facilité de la manipulation de ce virus en culture de cellules in vitro, et le nombre réduit d’antiviraux à tester (2 ou 3).

E.5 Conclusion

Ainsi, des examens de complexité diverse, choisis en fonctions des techniques disponibles et des renseignements cliniques, donc par concertation permanente entre praticien et virologiste, et effectués au bon moment, concourent au diagnostic, au traitement et à la prévention des infections virales.