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Biologie Moléculaire

Plan du cours

Objectifs PAES commun DHU Paris-Est

I - La structure des acides nucléiques

1 - Molécules simples

2 - Les acides nucléiques

II - Biosynthèse des macromolécules

3 - DNA Définitions

4 - La transcription

5 - La traduction

6 - La réplication

7 - La réparation

III - Les événements génétiques

8 - Substitutions

9 - Mutations

10 - Insertions - délétions

11 - Transpositions

IV - L’évolution

12 - Divergence

13 - Familles de gènes

V - Le DNA au laboratoire

14 - Méthodes d’étude


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traduction HTML V2.8
V. Morice


Partie V - Le DNA au laboratoire
Chapitre 14 - Méthodes d’étude

 

14.16 - Réaction de séquence

 

Image BM_19_PICT.gif
BM 19

  • Pour lire la séquence d’un DNA simple brin on hybride une amorce du côté 3’ de ce DNA. Puis on effectue avec une DNA polymérase la synthèse d’un brin complémentaire.
  • La condensation se fait à partir d’un substrat « activé » : un des nucléosides triphosphates. La rupture d’une liaison riche en énergie fournira l’énergie nécessaire à la condensation. Le nucléoside monophosphate restant sera estérifié par une fonction acide de son phosphate sur la fonction alcool libre du carbone 3’ du ribose qui constitue l’extrémité de l’acide nucléique.
  • Pour cette synthèse on apporte comme substrats les quatre désoxyribonucléosides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP). En plus une très petite quantité de didésoxyribonucléosides triphosphates fluorescents (ddATP-JOE, ddCTP-5-FAM, ddGTP-TAMRA et ddTTP-ROX). La polymérase choisira le plus souvent un désoxyribonucléoside normal et la synthèse se poursuivra jusqu’à ce qu’elle incorpore un didésoxyribonucléoside fluorescent.
  • A ce stade le brin en cours de synthèse n’a plus d’extrémité 3’-OH et la réaction de polycondensation ne peut plus se poursuivre.
  • Le didésoxyribonucléotide incorporé en dernier est fluorescent et émet sous l’excitation une lumière verte pour JOE (ddAMP), bleue pour 5-FAM (ddCMP), jaune pour TAMRA (ddGMP) et rouge pour ROX (ddTMP).
  • A chaque lettre de la polycondensation un petit nombre de molécules sont ainsi arrêtées et marquées de la fuorescence correspondant au dernier nucléotide incorporé.
  • En séparant ces molécules par électrophorèse en fonction de leur taille on peut lire les lettres successives qui apparaissent comme des zones sur l’électrophorégramme dont la fluorescence correspond à la base de ce dernier nucléotide.

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14.1 - Extraction et purification du DNA
14.2 - Synthèse d’un cDNA
14.3 - Electrophorèse de DNA
14.4 - Hae III (enzyme de restriction)
14.5 - EcoR I
14.6 - Polymorphisme de restriction
14.7 - Polymorphisme Msp I de l’apoA-II
14.8 - Cartes de restriction
14.9 - Hybridation d’une sonde
14.10 - Calcul de la Tm
14.11 - Sonde hybridée
14.12 - Sonde spécifique d’allèle (ASO)
14.13 - Southern blot
14.14 - PCR
14.15 - Didésoxyadénosine triphosphate
14.16 - Réaction de séquence
14.17 - Séquençage d’ADN
14.18 - Gel de séquence