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Biologie génique

Plan du cours

Objectifs

I - Enzymes agissant sur les acides nucléiques

1 - Phosphorylation - déphosphorylation

2 - Les polymérases

3 - Les ligases

4 - Les isomérases

5 - Les nucléases

6 - Autres enzymes

II - Préparation des acides nucléiques

7 - Extraction et purification

8 - Synthèse des polynucléotides

9 - Caractérisation des acides nucléiques

III - Caractérisation des événements génétiques

10 - Mutations

11 - Expression

IV - Le génie génétique

12 - Mutagénèse

13 - Transposition - recombinaison

14 - Construction de vecteurs

15 - Transgénèse


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traduction HTML V2.8
V. Morice


Objectifs

 

 

Des connaissances de base en enzymologie, en virologie et en biochimie des acides nucléiques sont indispensables pour suivre cet enseignement. (Objectifs pré-requis).

  1. Enzymes agissant sur les acides nucléiques
    • Pour chacune des enzymes suivantes, utilisées au laboratoire de biologie moléculaire, connaître1 les facteurs en présence utiles à la réaction (substrat, modèles, produits, cofacteurs, effecteurs, conditions physiques), la spécificité de l’activité enzymatique et donner des exemples de l’usage qu’on peut en faire : polynucléotide kinase, terminal transferase, phosphatase alcaline, DNA polymérases, reverse transcriptase, RNA polymérases, poly(A) polymérase, DNA ligases, RNA ligase, topoisomérase, enzymes de restriction, ribonucléases (A, T1, H), désoxyribonucléases, protéinase K, β-galactosidase.
  2. Préparation des acides nucléiques
    • Définir2 les termes suivants : oligonucléotide, sonde, ADN complémentaire.
    • Décrire les gestes3 qui permettent de faire l’extraction et la purification d’ADN génomique à partir d’un prélèvement de sang.
    • Expliquer le principe de l’extraction de l’ARN messager d’un tissu et de la réalisation pratique d’une banque de cDNA.
    • Décrire les gestes qui permettent de faire l’amplification par PCR d’un fragment d’ADN dont on possède les amorces.
    • Expliquer le principe de la synthèse d’un oligonucléotide au moyen d’un synthétiseur et de la technique des phosphoramidites.
    • Décrire les gestes qui permettent de faire la synthèse d’une queue de nucléotides à l’extrémité d’un fragment d’ADN.
    • Expliquer le principe du dosage des acides nucléiques. Faire le calcul de la quantité d’acides nucléiques à partir des données brutes fournies par un spectrophotomètre, en tenant compte des dilutions et du volume du milieu considéré.
    • Expliquer le principe de l’hybridation d’une sonde. Faire le calcul de la Tm de cette sonde à partir de sa séquence et d’une formule de calcul. Etablir les conditions des phases d’un programme de PCR utilisant deux amorces de Tm voisines. Expliquer les étapes des techniques d’hybridation moléculaire qui auront été pratiquées ou expliquées en cours à titre d’exemples : hybridation sur filtre, hybridation in situ, hybridation en solution.
    • Décrire le principe technique et les gestes qui permettent de faire le marquage d’une sonde par un atome de 32P ou par un nucléotide marqué.
    • Expliquer le principe du séquençage d’un fragment d’ADN au moyen d’un séquenceur et de la technique des dye primers ou des dye terminators ; décrire et interprèter les résultats4 apparaissant sur l’écran de l’ordinateur après un séquençage automatique.
    • Expliquer les principes de la recherche des éléments cis-régulateurs sur la séquence d’un promoteur (foot printing).
    • Expliquer le principe des réactions permettant le dosage des ARN transcrits : PCR quantitative, protection à la Rnase.
  3. Exemples d’applications
    • Décrire et interpréter les résultats d’analyse (sur un exemple emprunté au cours, aux T.P. ou à votre expérience personnelle) d’une lésion moléculaire conduisant à une expression anormale du gène considéré : mutation faux-sens, non-sens, décalage du cadre de lecture, protéine tronquée, …
    • Expliquer les étapes (sur un exemple emprunté au cours, aux T.P. ou à votre expérience personnelle) des techniques ayant permis : un diagnostic génotypique, une analyse génique ou une empreinte génétique : RFLP, carte de restriction, haplotypes, séquençage.
  4. Génie génétique
    • Définir les termes suivants : vecteur, clonage, polylinker, plasmide.
    • Décrire les étapes de l’insertion d’un fragment d’ADN dans un plasmide.
    • Expliquer les étapes (sur un exemple emprunté au cours, aux T.P. ou à votre expérience personnelle) des techniques ayant permis : une mutagénèse, la transposition d’un gène dans une bactérie, la création d’un animal ou d’une plante transgénique.
    • Expliquer le principe de la construction d’un vecteur : cet objectif servira à tester la faculté pour l’étudiant(e) de faire une synthèse des connaissances de l’ensemble des chapitres précedents.



1. Connaître
  • corps chimique : écrire sa formule développée, énumérer les molécules simples dans une structure complexe et nommer les liaisons qui les unissent, expliquer une expérience mettant en évidence une propriété chimique ou physique ;
  • image : dessiner un objet ou une structure ;
  • réaction : écrire l’équation chimique ;
  • voie métabolique : établir son bilan chimique à partir des réactions de chaque enzyme.

2. Définir : préciser dans une phrase concise l’essence d’un objet ou les limites d’un concept en excluant toute notion étrangère et en comprenant toutes les variations possibles de l’objet ou du concept cerné.
3. Expliquer le principe, décrire ou mimer les gestes ou faire un schéma explicatif : préciser le motif de chacun de ces gestes. Etre capable de déceler une erreur qualitative dans la description d’un protocole.
Au niveau des travaux pratiques, les connaissances techniques théoriques étant acquises, on devra être capable de passer à la manipulation sans avoir à apprendre que la partie proprement manuelle.
4. Interpreter les résultats : à partir des données affichées par la machine, après la validation technique de la séquence, savoir décrire la structure de l’acide nucléique séquençé et reconnaître sur cette séquence des lésions moléculaires dont l’interprétation ne nécessite la levée d’aucune ambiguïté.

 

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