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Biologie génique

Plan du cours

Objectifs

I - Enzymes agissant sur les acides nucléiques

1 - Phosphorylation - déphosphorylation

2 - Les polymérases

3 - Les ligases

4 - Les isomérases

5 - Les nucléases

6 - Autres enzymes

II - Préparation des acides nucléiques

7 - Extraction et purification

8 - Synthèse des polynucléotides

9 - Caractérisation des acides nucléiques

III - Caractérisation des événements génétiques

10 - Mutations

11 - Expression

IV - Le génie génétique

12 - Mutagénèse

13 - Transposition - recombinaison

14 - Construction de vecteurs

15 - Transgénèse


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traduction HTML V2.8
V. Morice


Partie II - Préparation des acides nucléiques
Chapitre 9 - Caractérisation des acides nucléiques

 

9.26 - Dosage d’ARN : protection à la RNase

 

Image BG_77_PICT.jpg
BG 77

  • Pour détecter et doser un mRNA connu parmi les RNA-poly(A) d’un tissu, on peut faire une hybridation spécifique avec une sonde marquée.
  • La sonde est un RNA complémentaire du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d’un mRNA connu dont le cDNA, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. L’insert « sens » sert de modèle à une T3 RNA polymérase qui va synthétiser un RNA « antisens » complémentaire du mRNA de départ. Cette sonde « antisens » sera marquée (radioactive).
  • 100 μg de RNA-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher sont incubés avec cette sonde dans des conditions d’hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides RNA:RNA entre le mRNA recherché et la sonde antisens.
  • Le milieu hybridé est alors incubé avec un mélange de ribonucléases toutes spécifiques du RNA simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion.
  • Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé et repurifié, avant d’être analysé par électrophorèse. Les RNA hybrides marqués sont détectés par autoradiographie.

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9.1 - Principaux oligonucléotides
9.2 - Spectres UV des bases nucléiques
9.3 - Spectre UV des acides aminés
9.4 - Dosage des acides nucléiques
9.5 - Electrophorèse des acides nucléiques
9.6 - Sonde nucléique (définition)
9.7 - Hybridation d’une sonde
9.8 - Calcul de la Tm
9.9 - Southern blot
9.10 - Drépanocytose (anémie falciforme)
9.11 - Marquage : nick translation
9.12 - Marquage : random priming
9.13 - Marquage : terminal transferase
9.14 - Marquage : polynucléotide kinase
9.15 - Didésoxyadénosine triphosphate
9.16 - Réaction de séquence
9.17 - Séquençage de l’ADN
9.18 - Séquençage : dye primers
9.19 - Séquençage : dye terminators
9.20 - Gel de séquence
9.21 - Séquençage : image du gel
9.22 - Séquençage : analyse de l’image
9.23 - Séquençage : analyse de l’image
9.24 - Promoteur : foot printing
9.25 - Dosage d’ARN : PCR quantitative
9.26 - Dosage d’ARN : protection à la RNase