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Plan du cours Objectifs I - Enzymes agissant sur les acides nucléiques 1 - Phosphorylation - déphosphorylation 2 - Les polymérases 3 - Les ligases 4 - Les isomérases 5 - Les nucléases 6 - Autres enzymes II - Préparation des acides nucléiques 7 - Extraction et purification 8 - Synthèse des polynucléotides 9 - Caractérisation des acides nucléiques III - Caractérisation des événements génétiques 10 - Mutations 11 - Expression IV - Le génie génétique 12 - Mutagénèse 13 - Transposition - recombinaison 14 - Construction de vecteurs 15 - Transgénèse
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traduction HTML V2.7
V. Morice
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Partie II - Préparation des acides nucléiques
Chapitre 9 - Caractérisation des acides nucléiques | | |
9.26 - Dosage d’ARN : protection à la RNase
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| BG 77 |
- Pour détecter et doser un mRNA connu parmi les RNA-poly(A) d’un tissu, on peut faire une hybridation spécifique avec une sonde marquée.
- La sonde est un RNA complémentaire du messager à rechercher. Elle peut être construite à partir d’un mRNA connu dont le cDNA, après RT-PCR, a été cloné dans un phage. L’insert « sens » sert de modèle à une T3 RNA polymérase qui va synthétiser un RNA « antisens » complémentaire du mRNA de départ. Cette sonde « antisens » sera marquée (radioactive).
- 100 μg de RNA-poly(A) du tissu où la séquence est à rechercher sont incubés avec cette sonde dans des conditions d’hybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides RNA:RNA entre le mRNA recherché et la sonde antisens.
- Le milieu hybridé est alors incubé avec un mélange de ribonucléases toutes spécifiques du RNA simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides formés avec la sonde peuvent résister à cette digestion.
- Le produit de digestion est ensuite déprotéinisé et repurifié, avant d’être analysé par électrophorèse. Les RNA hybrides marqués sont détectés par autoradiographie.
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