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Biologie génique

Plan du cours

Objectifs

I - Enzymes agissant sur les acides nucléiques

1 - Phosphorylation - déphosphorylation

2 - Les polymérases

3 - Les ligases

4 - Les isomérases

5 - Les nucléases

6 - Autres enzymes

II - Préparation des acides nucléiques

7 - Extraction et purification

8 - Synthèse des polynucléotides

9 - Caractérisation des acides nucléiques

III - Caractérisation des événements génétiques

10 - Mutations

11 - Expression

IV - Le génie génétique

12 - Mutagénèse

13 - Transposition - recombinaison

14 - Construction de vecteurs

15 - Transgénèse


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traduction HTML V2.8
V. Morice


Partie II - Préparation des acides nucléiques
Chapitre 9 - Caractérisation des acides nucléiques

 

9.25 - Dosage d’ARN : PCR quantitative

 

Image BG_76_PICT.jpg
BG 76

  • Pour mesurer l’expression d’un gène dans une cellule, on doit doser le taux du messager correspondant dans le cytoplasme. Ce taux dépend de la régulation de la transcription, mais aussi de la durée de vie du messager.
  • Les différents mRNA sont amplifiés par une RT-PCR qui donne des cDNA dont les taux relatifs sont équivalents à ceux des mRNA qui ont servi de modèles.
  • Afin de mesurer spécifiquement un messager précis on construit un DNA identique à ce messager, reconnaissable aux extrémités par les mêmes amorces, mais présentant une délétion au centre de la séquence le rendant plus court que le cDNA à rechercher. Dans une série de PCR on introduit le cDNA à doser, le DNA compétitif à des taux croissants pour faire une gamme de dosage, les amorces communes aux deux DNA et les autres facteurs pour la réaction.
  • Dans l’électrophorèse qui suit, les cDNA amplifiés de concentration inconnue migrent moins que les DNA compétitifs de concentrations connues pour chaque puits. Les concentrations restant proportionnelles au cours de la PCR, la concentration du cDNA à doser est celle qui correspond à la concentration du DNA compétitif dans le tube où les deux taches de BET sont d’intensités égales.
  • Pour pouvoir comparer les dosages des mRNA on fait en même temps (comme étalon interne) le dosage du mRNA d’un gène d’expression ubiquitaire et d’expression constante, par exemple actine ou facteur TFIID.

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9.1 - Principaux oligonucléotides
9.2 - Spectres UV des bases nucléiques
9.3 - Spectre UV des acides aminés
9.4 - Dosage des acides nucléiques
9.5 - Electrophorèse des acides nucléiques
9.6 - Sonde nucléique (définition)
9.7 - Hybridation d’une sonde
9.8 - Calcul de la Tm
9.9 - Southern blot
9.10 - Drépanocytose (anémie falciforme)
9.11 - Marquage : nick translation
9.12 - Marquage : random priming
9.13 - Marquage : terminal transferase
9.14 - Marquage : polynucléotide kinase
9.15 - Didésoxyadénosine triphosphate
9.16 - Réaction de séquence
9.17 - Séquençage de l’ADN
9.18 - Séquençage : dye primers
9.19 - Séquençage : dye terminators
9.20 - Gel de séquence
9.21 - Séquençage : image du gel
9.22 - Séquençage : analyse de l’image
9.23 - Séquençage : analyse de l’image
9.24 - Promoteur : foot printing
9.25 - Dosage d’ARN : PCR quantitative
9.26 - Dosage d’ARN : protection à la RNase