Partie II - Préparation des acides nucléiques
Chapitre 9 - Caractérisation des acides nucléiques

9.19 - Séquençage : dye terminators

BG 73/1

• La réaction de séquençage est une technique de synthèse de DNA analogue à la PCR. On utilise des amorces marquées (dye primers) ou des nucléotides marqués (dye terminators).
• Pour séquencer ce fragment de 244 nt on utilisera une seule amorce spécifique pour chacun des deux brins d’ADN et complémentaire de l’extrémité 3’ de ce brin. Elle sera incubée avec le tampon, la DNA polymérase, les quatre dNTP et en addition une quantité plus faible des quatre didésoxynucléotides ddATP (lié au fluorochrome JOE = vert), ddCTP (lié au fluorochrome 5-FAM = bleu), ddGTP (lié au fluorochrome TAMRA = jaune) et ddTTP (lié au fluorochrome ROX = rouge). L’incorporation de ces didésoxynucléotides marqués va interrompre la synthèse de façon aléatoire mais toujours au niveau de la lettre correspondante de la séquence.
• Tous les fragments synthétisés seront mis dans une électrophorèse qui les séparera en fonction de leur masse moléculaire donc du nombre de nucléotides et on enregistrera la couleur du fluorochrome qui indiquera spécifiquement les fragments se terminant par chacun des quatre didésoxyribonucléotides marqués. La séquence de ces couleurs indique la séquence de l’ADN : vert pour A, rouge pour T, bleu pour C et jaune pour G.
• On contrôle enfin la séquence obtenue par celle obtenue avec une amorce s’hybridant avec le brin du dessous, cette seconde séquence devant être antiparallèle et complémentaire de la première.