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Biologie génique

Plan du cours

Objectifs

I - Enzymes agissant sur les acides nucléiques

1 - Phosphorylation - déphosphorylation

2 - Les polymérases

3 - Les ligases

4 - Les isomérases

5 - Les nucléases

6 - Autres enzymes

II - Préparation des acides nucléiques

7 - Extraction et purification

8 - Synthèse des polynucléotides

9 - Caractérisation des acides nucléiques

III - Caractérisation des événements génétiques

10 - Mutations

11 - Expression

IV - Le génie génétique

12 - Mutagénèse

13 - Transposition - recombinaison

14 - Construction de vecteurs

15 - Transgénèse


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traduction HTML V2.8
V. Morice


Partie II - Préparation des acides nucléiques
Chapitre 9 - Caractérisation des acides nucléiques

 

9.18 - Séquençage : dye primers

 

Image BG_73_PICT.jpg
BG 73

  • La réaction de séquençage est une technique de synthèse de DNA analogue à la PCR. On utilise des amorces marquées (dye primers) ou des nucléotides marqués (dye terminators).
  • Pour séquencer ce fragment de 244 nt on utilisera quatre amorces différentes pour chacun des deux brins d’ADN :
    • la première amorce liée au fluorochrome JOE (vert) se termine par une séquence complémentaire de l’extrémité 3’ du brin du dessus ; elle sera incubée avec le tampon, la DNA polymérase, les quatre dNTP et en addition une quantité plus faible du didésoxynucléotide ddATP (nucléotide dont les carbones 2 et 3 du ribose n’ont plus de fonctions alcool). L’incorporation de ce dernier va interrompre la synthèse de façon aléatoire mais toujours au niveau d’un A de la séquence.
    • la deuxième amorce marquée ROX (rouge) sera arrêtée par du ddTTP
    • la troisième amorce marquée 5-FAM (bleu) sera arrêtée par du ddCTP
    • la quatrième amorce enfin, marquée par TAMRA (jaune) sera arrêtée par du ddGTP.
  • Tous les fragments synthétisés seront mis ensemble dans une électrophorèse qui les séparera en fonction de leur masse moléculaire donc du nombre de nucléotides et on enregistrera la couleur de l’amorce qui indiquera spécifiquement les fragments se terminant par chacun des quatre didésoxyribonucléotides. La séquence de ces couleurs indique la séquence de l’ADN : vert pour A, rouge pour T, bleu pour C et jaune pour G.
  • On contrôle enfin la séquence obtenue par celle obtenue avec des amorces s’hybridant avec le brin du dessous, cette seconde séquence devant être antiparallèle et complémentaire de la première.

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9.1 - Principaux oligonucléotides
9.2 - Spectres UV des bases nucléiques
9.3 - Spectre UV des acides aminés
9.4 - Dosage des acides nucléiques
9.5 - Electrophorèse des acides nucléiques
9.6 - Sonde nucléique (définition)
9.7 - Hybridation d’une sonde
9.8 - Calcul de la Tm
9.9 - Southern blot
9.10 - Drépanocytose (anémie falciforme)
9.11 - Marquage : nick translation
9.12 - Marquage : random priming
9.13 - Marquage : terminal transferase
9.14 - Marquage : polynucléotide kinase
9.15 - Didésoxyadénosine triphosphate
9.16 - Réaction de séquence
9.17 - Séquençage de l’ADN
9.18 - Séquençage : dye primers
9.19 - Séquençage : dye terminators
9.20 - Gel de séquence
9.21 - Séquençage : image du gel
9.22 - Séquençage : analyse de l’image
9.23 - Séquençage : analyse de l’image
9.24 - Promoteur : foot printing
9.25 - Dosage d’ARN : PCR quantitative
9.26 - Dosage d’ARN : protection à la RNase