médecine
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Biologie génique

Plan du cours

Objectifs

I - Enzymes agissant sur les acides nucléiques

1 - Phosphorylation - déphosphorylation

2 - Les polymérases

3 - Les ligases

4 - Les isomérases

5 - Les nucléases

6 - Autres enzymes

II - Préparation des acides nucléiques

7 - Extraction et purification

8 - Synthèse des polynucléotides

9 - Caractérisation des acides nucléiques

III - Caractérisation des événements génétiques

10 - Mutations

11 - Expression

IV - Le génie génétique

12 - Mutagénèse

13 - Transposition - recombinaison

14 - Construction de vecteurs

15 - Transgénèse


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traduction HTML V2.8
V. Morice


Partie II - Préparation des acides nucléiques
Chapitre 9 - Caractérisation des acides nucléiques

 

9.16 - Réaction de séquence

 

Image BG_71_6_PICT.jpg
BG 71/6

  • Pour lire la séquence d’un DNA simple brin on hybride une amorce du côté 3’ de ce DNA. Puis on effectue avec une DNA polymérase la synthèse d’un brin complémentaire.
  • Pour cette synthèse on apporte comme substrats les quatre désoxyribonucléosides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP). En plus une très petite quantité de didésoxyribonucléosides triphosphates fluorescents (ddATP-JOE, ddCTP-5-FAM, ddGTP-TAMRA et ddTTP-ROX). La polymérase choisira le plus souvent un désoxyribonucléoside normal et la synthèse se poursuivra jusqu’à ce qu’elle incorpore un didésoxyribonucléoside fluorescent.
  • A ce stade le brin en cours de synthèse n’a plus d’extrémité 3’-OH et la réaction de polycondensation ne peut plus se poursuivre.
  • Le didésoxyribonucléotide incorporé en dernier est fluorescent et émet sous l’excitation une lumière verte pour JOE (ddAMP), bleue pour 5-FAM (ddCMP), jaune pour TAMRA (ddGMP) et rouge pour ROX (ddTMP).
  • A chaque lettre de la polycondensation un petit nombre de molécules sont ainsi arrêtées et marquées de la fuorescence correspondant au dernier nucléotide incorporé.
  • En séparant ces molécules par électrophorèse en fonction de leur taille on peut lire les lettres successives qui apparaissent comme des zones sur l’électrophorégramme dont la fuorescence correspond à la base de ce dernier nucléotide.

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9.1 - Principaux oligonucléotides
9.2 - Spectres UV des bases nucléiques
9.3 - Spectre UV des acides aminés
9.4 - Dosage des acides nucléiques
9.5 - Electrophorèse des acides nucléiques
9.6 - Sonde nucléique (définition)
9.7 - Hybridation d’une sonde
9.8 - Calcul de la Tm
9.9 - Southern blot
9.10 - Drépanocytose (anémie falciforme)
9.11 - Marquage : nick translation
9.12 - Marquage : random priming
9.13 - Marquage : terminal transferase
9.14 - Marquage : polynucléotide kinase
9.15 - Didésoxyadénosine triphosphate
9.16 - Réaction de séquence
9.17 - Séquençage de l’ADN
9.18 - Séquençage : dye primers
9.19 - Séquençage : dye terminators
9.20 - Gel de séquence
9.21 - Séquençage : image du gel
9.22 - Séquençage : analyse de l’image
9.23 - Séquençage : analyse de l’image
9.24 - Promoteur : foot printing
9.25 - Dosage d’ARN : PCR quantitative
9.26 - Dosage d’ARN : protection à la RNase