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Plan du cours Objectifs I - Enzymes agissant sur les acides nucléiques 1 - Phosphorylation - déphosphorylation 2 - Les polymérases 3 - Les ligases 4 - Les isomérases 5 - Les nucléases 6 - Autres enzymes II - Préparation des acides nucléiques 7 - Extraction et purification 8 - Synthèse des polynucléotides 9 - Caractérisation des acides nucléiques III - Caractérisation des événements génétiques 10 - Mutations 11 - Expression IV - Le génie génétique 12 - Mutagénèse 13 - Transposition - recombinaison 14 - Construction de vecteurs 15 - Transgénèse
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traduction HTML V2.7
V. Morice
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Partie II - Préparation des acides nucléiques
Chapitre 8 - Synthèse des polynucléotides | | |
8.19 - Sondes de cDNA amplifié
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| BG 56/1 |
- On peut effectuer directement la synthèse biologique d’une sonde à partir d’un ARN messager, isolé dans la fraction des RNA-poly(A).
- Dans une première étape, une amorce oligo d(T) est hybridée avec les séquences poly(A) des ARN messagers et la transcriptase réverse permet la synthèse d’un cDNA.
- Dans la seconde étape, une amorce spécifique permet de synthétiser le second brin d’un cDNA correspondant à l’amorce choisie.
- Enfin, la PCR permettra d’amplifier les deux brins d’ADN jusqu’à l’obtention d’une quantité suffisante de la sonde. Au cours de cette PCR on peut marquer la sonde avec un nucléotide radioactif ou biotinylé. Si la spécificité de l’amorce n’est pas suffisante, une seconde paire d’amorces spécifiques permettra d’obtenir la séquence recherchée (nested-PCR).
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