Partie II - Préparation des acides nucléiques
Chapitre 8 - Synthèse des polynucléotides

8.18 - Synthèse d’un cDNA

BG 56

• La manipulation et l’étude des RNA est difficile à cause de leur grande sensibilité aux ribonucléases qui les détruisent.
• Il est nécessaire de recopier la séquence en DNA pour qu’elle soit plus stable et qu’on puisse l’amplifier en fonction des besoins.
• Le mRNA purifié (chromatographie d’affinité sur une colonne d’oligo-d(T)) est lié dans un premier temps avec des oligonucléotides poly(T) qui s’attachent à la queue poly(A).
• A partir de l’extrémité 3’ de cette amorce poly(T) la transcriptase réverse, qui est une DNA polymérase, synthétise un brin de DNA complémentaire du messager de départ.
• Une fois cette synthèse achevée on dégrade le RNA par une base forte ou par une ribonucléase spécifique.
• Le brin de DNA fabriqué forme spontanément à son extrémité 3’ une boucle en épingle à cheveux en s’hybridant sur lui-même.
• L’extrémité 3’ de cette boucle va servir de site de démarrage pour la DNA polymérase qui va synthétiser un brin de DNA complémentaire du premier.
• Une nucléase spécifique du DNA simple brin supprimera la boucle de l’extrémité. Le cDNA double brin est prêt.
• On peut ainsi constituer autant de cDNA qu’il existe de messagers dans une cellule : l’ensemble de ces cDNA forme une « banque de cDNA ».