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Plan du cours Objectifs I - Enzymes agissant sur les acides nucléiques 1 - Phosphorylation - déphosphorylation 2 - Les polymérases 3 - Les ligases 4 - Les isomérases 5 - Les nucléases 6 - Autres enzymes II - Préparation des acides nucléiques 7 - Extraction et purification 8 - Synthèse des polynucléotides 9 - Caractérisation des acides nucléiques III - Caractérisation des événements génétiques 10 - Mutations 11 - Expression IV - Le génie génétique 12 - Mutagénèse 13 - Transposition - recombinaison 14 - Construction de vecteurs 15 - Transgénèse
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traduction HTML V2.7
V. Morice
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Partie II - Préparation des acides nucléiques
Chapitre 7 - Extraction et purification | | |
7.1 - Purification des lymphocytes
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| BG 46 |
- Le prélèvement de sang veineux au pli du coude est la technique la plus employée pour obtenir de l’ADN génomique. Le sang est recueilli sur EDTA, chélateur des ions divalents, cofacteurs des nucléases.
- Pour faciliter l’extraction de l’ADN on isole du sang total un culot de cellules nucléées, les lymphocytes.
- Le sang est d’abord déposé en gradient de densité dans un tube à centrifuger, au-dessus d’une couche de polyfluorocarbone liquide (Ficoll ®) de densité 1,077. Le plasma flotte au dessus de ce produit car sa densité est de 1,006. Puis on centrifuge ce gradient pendant 25 min à 700 g à la température ambiante.
- Les lymphocytes et d’autres cellules blanches sont recueillies à la limite supérieure de la couche de Ficoll, tandis que les autres cellules plus denses ont sédimenté au fond du tube.
- Les lymphocytes sont enfin lavés dans du NaCl 0,15 M et recentrifugés 10 min dans les mêmes conditions. Ils forment après cette deuxième centrifugation un culot blanc au fond du tube.
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