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Biologie génique

Plan du cours

Objectifs

I - Enzymes agissant sur les acides nucléiques

1 - Phosphorylation - déphosphorylation

2 - Les polymérases

3 - Les ligases

4 - Les isomérases

5 - Les nucléases

6 - Autres enzymes

II - Préparation des acides nucléiques

7 - Extraction et purification

8 - Synthèse des polynucléotides

9 - Caractérisation des acides nucléiques

III - Caractérisation des événements génétiques

10 - Mutations

11 - Expression

IV - Le génie génétique

12 - Mutagénèse

13 - Transposition - recombinaison

14 - Construction de vecteurs

15 - Transgénèse


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traduction HTML V2.8
V. Morice


Partie II - Préparation des acides nucléiques
Chapitre 7 - Extraction et purification

 

7.1 - Purification des lymphocytes

 

Image BG_46_PICT.jpg
BG 46

  • Le prélèvement de sang veineux au pli du coude est la technique la plus employée pour obtenir de l’ADN génomique. Le sang est recueilli sur EDTA, chélateur des ions divalents, cofacteurs des nucléases.
  • Pour faciliter l’extraction de l’ADN on isole du sang total un culot de cellules nucléées, les lymphocytes.
  • Le sang est d’abord déposé en gradient de densité dans un tube à centrifuger, au-dessus d’une couche de polyfluorocarbone liquide (Ficoll ®) de densité 1,077. Le plasma flotte au dessus de ce produit car sa densité est de 1,006. Puis on centrifuge ce gradient pendant 25 min à 700 g à la température ambiante.
  • Les lymphocytes et d’autres cellules blanches sont recueillies à la limite supérieure de la couche de Ficoll, tandis que les autres cellules plus denses ont sédimenté au fond du tube.
  • Les lymphocytes sont enfin lavés dans du NaCl 0,15 M et recentrifugés 10 min dans les mêmes conditions. Ils forment après cette deuxième centrifugation un culot blanc au fond du tube.

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7.1 - Purification des lymphocytes
7.2 - Homogénéisation des tissus, déprotéinisation
7.3 - Extraction de l’ADN
7.4 - Isolation de l’ARN
7.5 - Techniques de purification (tableau)
7.6 - Purification par l’éthanol
7.7 - Purification du RNA-poly(A)