|
Plan du cours Objectifs I - Enzymes agissant sur les acides nucléiques 1 - Phosphorylation - déphosphorylation 2 - Les polymérases 3 - Les ligases 4 - Les isomérases 5 - Les nucléases 6 - Autres enzymes II - Préparation des acides nucléiques 7 - Extraction et purification 8 - Synthèse des polynucléotides 9 - Caractérisation des acides nucléiques III - Caractérisation des événements génétiques 10 - Mutations 11 - Expression IV - Le génie génétique 12 - Mutagénèse 13 - Transposition - recombinaison 14 - Construction de vecteurs 15 - Transgénèse
Tous droits de reproduction réservés aux auteurs
traduction HTML V2.7
V. Morice
|
 |
Partie II - Préparation des acides nucléiques
Chapitre 7 - Extraction et purification | | |
7.7 - Purification du RNA-poly(A)
 |
| BG 52 |
- Parmi les acides ribonucléiques extraits des cellules, la classe la plus étudiée est celle des ARN messagers. Ils se caractérisent par la présence du côté 3’-terminal d’une longue queue poly(A) synthétisée à la phase post-transcriptionnelle.
- On utilisera une chromatographie d’affinité entre cette queue poly(A) et une colonne dont la phase fixe est pourvue de fragments d’oligo(dT) de quelques dizaines de nucléotides qui peuvent s’hybrider avec les RNA poly(A).
- Après avoir lavé la colonne en milieu alcalin (potasse), on charge les RNA totaux à haute force ionique (KCl 0,5 M) puis on rince la colonne avec du KCl 0,1 M en surveillant l’absorbance de l’éluat à 260 nm pour s’assurer de l’élimination des RNA non retenus par la colonne (rRNA, tRNA,... ). Enfin, on élue la fraction retenue par la colonne en abaissant la concentration de KCl à 0,01 M et en élevant la température.
- Un micro essai avec la reverse transcriptase permet de s’assurer de la qualité de ce RNA poly(A) comme matrice pour la synthèse de cDNA.
| |
| |
