médecine
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Biologie génique

Plan du cours

Objectifs

I - Enzymes agissant sur les acides nucléiques

1 - Phosphorylation - déphosphorylation

2 - Les polymérases

3 - Les ligases

4 - Les isomérases

5 - Les nucléases

6 - Autres enzymes

II - Préparation des acides nucléiques

7 - Extraction et purification

8 - Synthèse des polynucléotides

9 - Caractérisation des acides nucléiques

III - Caractérisation des événements génétiques

10 - Mutations

11 - Expression

IV - Le génie génétique

12 - Mutagénèse

13 - Transposition - recombinaison

14 - Construction de vecteurs

15 - Transgénèse


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traduction HTML V2.8
V. Morice


Partie II - Préparation des acides nucléiques
Chapitre 7 - Extraction et purification

 

7.7 - Purification du RNA-poly(A)

 

Image BG_52_PICT.jpg
BG 52

  • Parmi les acides ribonucléiques extraits des cellules, la classe la plus étudiée est celle des ARN messagers. Ils se caractérisent par la présence du côté 3’-terminal d’une longue queue poly(A) synthétisée à la phase post-transcriptionnelle.
  • On utilisera une chromatographie d’affinité entre cette queue poly(A) et une colonne dont la phase fixe est pourvue de fragments d’oligo(dT) de quelques dizaines de nucléotides qui peuvent s’hybrider avec les RNA poly(A).
  • Après avoir lavé la colonne en milieu alcalin (potasse), on charge les RNA totaux à haute force ionique (KCl 0,5 M) puis on rince la colonne avec du KCl 0,1 M en surveillant l’absorbance de l’éluat à 260 nm pour s’assurer de l’élimination des RNA non retenus par la colonne (rRNA, tRNA,... ). Enfin, on élue la fraction retenue par la colonne en abaissant la concentration de KCl à 0,01 M et en élevant la température.
  • Un micro essai avec la reverse transcriptase permet de s’assurer de la qualité de ce RNA poly(A) comme matrice pour la synthèse de cDNA.

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7.1 - Purification des lymphocytes
7.2 - Homogénéisation des tissus, déprotéinisation
7.3 - Extraction de l’ADN
7.4 - Isolation de l’ARN
7.5 - Techniques de purification (tableau)
7.6 - Purification par l’éthanol
7.7 - Purification du RNA-poly(A)