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Biologie génique

Plan du cours

Objectifs

I - Enzymes agissant sur les acides nucléiques

1 - Phosphorylation - déphosphorylation

2 - Les polymérases

3 - Les ligases

4 - Les isomérases

5 - Les nucléases

6 - Autres enzymes

II - Préparation des acides nucléiques

7 - Extraction et purification

8 - Synthèse des polynucléotides

9 - Caractérisation des acides nucléiques

III - Caractérisation des événements génétiques

10 - Mutations

11 - Expression

IV - Le génie génétique

12 - Mutagénèse

13 - Transposition - recombinaison

14 - Construction de vecteurs

15 - Transgénèse


Tous droits de reproduction réservés aux auteurs


traduction HTML V2.8
V. Morice


Partie IV - Le génie génétique
Chapitre 14 - Construction de vecteurs

 

14.2 - Construction d’un vecteur

 

Image BG_96_PICT.jpg
BG 96

  • Le clonage de la β-globine dans un vecteur eucaryote a été décrit par Mulligan, Howard et Berg (Nature 1979; 277: 108-114).
  • Le DNA du virus SV 40 a été digéré partiellement par Hind III, de façon à ne produire qu’une brèche à la position 1708, qui correspond au site d’initiation de la traduction de la protéine virale VP1. Puis le produit a été digéré à nouveau par BamH I qui n’a qu’un seul site en 2469 proche du site poly(A) du messager de cette protéine. Le produit est un vecteur d’expression nommé SVGT-5 de 4,2 Kb.
  • Le gène de la β-globine du lapin a été isolé. On a fait des bouts francs grâce à la nucléase S1 et à la DNA polymérase de E.coli. Sur ces bouts francs on a lié avec la DNA ligase de T4, un chainon d’ADN double brin, à bouts francs, de séquence CCAAGCTTGG, comportant un site de restriction pour Hind III (chaînon Hind III). L’ADN ainsi construit a été digéré par cette enzyme de restriction pour produire des bouts collants Hind III.
  • Le plasmide pBR322 a été également digéré par Hind III en un site unique et le clonage de l’ADN de globine préparé ci-dessus a été fait dans cette ouverture Hind III. Le plasmide obtenu a servi à transfecter des colonies de E. coli K12 (HB 101) qu’on a fait pousser en présence d’ampicilline. On a sélectionné ensuite des colonies qui n’étaient plus résistantes à la tétracycline : en effet le plasmide recombiné pBR322-βGb confère la résistance à l’ampicilline mais ne confère plus la résistance à la tétracycline.
  • On récupère l’insert amplifié en digérant les plasmides par Hind III et par Bgl II, cette dernière enzyme possédant un site unique à la fin de l’ADN de la β-globine. Enfin on a pu recombiner cet ADN de globine avec le vecteur SVGT-5 parce que les bouts collants des enzymes BamH I (g/gatcc) et Bgl II (a/gatct) ont la même séquence.

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14.1 - Carte du virus SV40
14.2 - Construction d’un vecteur
14.3 - Vecteurs hybrides