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Plan du cours Objectifs I - Enzymes agissant sur les acides nucléiques 1 - Phosphorylation - déphosphorylation 2 - Les polymérases 3 - Les ligases 4 - Les isomérases 5 - Les nucléases 6 - Autres enzymes II - Préparation des acides nucléiques 7 - Extraction et purification 8 - Synthèse des polynucléotides 9 - Caractérisation des acides nucléiques III - Caractérisation des événements génétiques 10 - Mutations 11 - Expression IV - Le génie génétique 12 - Mutagénèse 13 - Transposition - recombinaison 14 - Construction de vecteurs 15 - Transgénèse
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traduction HTML V2.7
V. Morice
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Partie IV - Le génie génétique
Chapitre 12 - Mutagénèse | | |
12.2 - Mutagénèse par PCR
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| BG 92 |
- La création d’une mutation artificielle peut être obtenue dans un gène par le jeu des amplifications à partir d’amorces modifiées.
- On prépare l’amplification du gène ou du cDNA grâce à deux amorces placées en amont et en aval de la séquence d’intérêt. On prépare aussi par synthèse des oligonucléotides conformes aux séquences des deux brins du gène autour du codon qui doit être modifié mais dont les bases sont volontairement changées pour qu’elles permettent la synthèse d’un brin complémentaire comprenant la substitution (ou la délétion...) souhaitée.
- On fait une première amplification entre chacune des amorces modifiées et les amorces des extrémités. En réunissant ces deux amplifications et en dénaturant l’ADN, on conduit à une renaturation entre les fragments au niveau des amorces centrales modifiées. Cette hybridation fait apparaître des extrémités 3’OH d’où l’élongation (Taq polymérase) peut se poursuivre jusqu’aux extrémités de la séquence d’intérêt. La poursuite des cycles en présence des amorces amont et aval conduit à l’amplification de cette séquence complète dans laquelle le codon muté a été inséré.
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