Bactériologie

Table des matières

1 - Anatomie fonctionnelle des bactéries

2 - Génétique bactérienne

3 - Staphylocoques

4 - Les streptocoques, entérocoques et pneumocoques

5 - Les neisseria

6 - Les bacilles à gram positif non sporules

7 - Entérobactéries et autres bacilles à gram négatif non exigeants

8 - Les bacilles a gram positif sporules

9 - Les bacilles à gram négatif hémophiles ou exigeants

10 - La flore microbienne normale de l'organisme

11 - Les spirochetes

12 - Mycobactéries

13 - Les rickettsia et bactéries voisines

14 - Les chlamydia

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V. Morice

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L'ADN bactérien peut être l'objet de variations qui se traduisent par l'apparition de différences héréditaires dans les structures et/ou les fonctions permanentes des bactéries. Les variations génétiques ou génotypiques (le génotype est l'ensemble des déterminants génétiques portés par une cellule) résultent d'une mutation, d'une transformation, d'une conjugaison, de l'acquisition d'un plasmide, d'une transduction,... en somme d'un changement de nature d'un ou plusieurs gènes. Les variations génétiques doivent être distinguées des variations phénétiques ou phénotypiques (le phénotype est l'ensemble des propriétés observables d'une cellule). Les premières affectent le génome bactérien dans sa séquence nucléotidique alors que les secondes affectent le comportement de la bactérie.

Les variations phénotypiques qui résultent de l'adaptation de l'ensemble d'une population bactérienne ayant le même génotype à diverses conditions extérieures sont réversibles, non transmissibles à la descendance mais spécifiques (non aléatoires). Leur mécanisme est en relation avec l'activité des gènes qui peut être régulée par des systèmes plus ou moins complexes : induction comme dans l'opéron lactose ; répression comme dans l'opéron tryptophane (Jacob et Monod 1961...).

2.1 Variations génétiques par mutation

La mutation est un changement, spontané ou provoqué par un agent mutagène, héréditaire (stable), brusque (discontinu), rare (10^-6 à 10^-9) et indépendant dans les caractères d'une bactérie, et qui est lié à une modification du génome bactérien (ADN). Il n'y a pas de différence de nature entre la mutation d'une cellule eucaryote et celle d'une cellule procaryote.

2.1.1 Caractères de la mutation bactérienne

Spontanéité (hasard) ou induction. Pour révéler la présence d'un mutant, il est nécessaire d'utiliser un moyen sélectif (par exemple milieu de culture avec un antibiotique, ou milieu minimum additionné d'un seul acide aminé). De ce fait on ne peut distinguer si la mutation est spontanée ou si elle est induite par l'agent sélectif. Le caractère spontané de la mutation a été formellement établi par l'analyse statistique de la distribution des mutants dans des tubes de bouillon de culture ensemencés en parallèle avec une même suspension microbienne (test de fluctuation de Luria et Delbruck, 1943) et par le test des répliques au tampon de velours, sans contact avec l'agent sélecteur (Lederberg et Lederberg, 1952).

1. Le test de fluctuation de Luria et Delbruck (figure 1) concerne la résistance d'E.coli à un bactériophage (virus qui infecte les bactéries et entraîne leur lyse). Une culture jeune en milieu liquide est divisée en deux parties égales de 10 ml. Chaque partie contient 1.000 cellules bactériennes. La première partie est gardée telle quelle dans un flacon, tandis que la seconde est subdivisée à parties égales (0,2 ml) en 50 petits tubes. Tous les tubes sont mis à cultiver à 37°C. Après culture, le contenu des tubes est étalé sur des géloses recouvertes de bactériophages : 50 échantillons égaux sont prélevés du flacon et étalés séparément ; le contenu de chacun des 50 petits tubes est aussi étalé séparement.
   On observe les faits suivants : le nombre de colonies bactériennes résistant aux bactériophages est à peu près le même, entre 3 et 7 colonies résistantes, sur chacune des cinquante géloses ensemencées à partir du flacon. En evanche, parmi les géloses ensemencées à partir des 50 petits tubes, certaines ne montrent pas de colonies résistantes, d'autres en montrent une centaine.
   L'explication du phénomène est la suivante : si les bactériophages induisaient la mutation vers la résistance après que les bactéries aient été exposées aux bactériophages, toutes les géloses devraient donner le même nombre de colonies résistant aux bactériophages. Si au contraire, les mutations se produisaient comme des évènements survenant au hasard dans les cultures bactériennes avant qu'elles ne soient exposées aux bactériophages, quelques-uns des petits tubes pourraient ne pas contenir de mutants, tandis que ceux dans lesquels les mutations seraient survenues tôt au cours de la période de culture devraient en contenir beaucoup. Donc, s'il y avait mutation, le nombre de colonies résistantes aux phages obtenues à partir des cinquante petits tubes devrait présenter un fort degré de fluctuation comparé au nombre de colonies résistantes provenant du flacon. C'est exactement ce que l'on observe ! Il s'agit donc d'une mutation spontanée et non d'une « mutation dirigée par les bactériophages ».
2. La culture par réplique de Lederberg et Lederberg (1952). Un morceau de velours stérile est tendu sur un cylindre de métal ou de bois dont le diamètre est légèrement plus petit qu'une boîte de Pétri. En appuyant légèrement le velours sur une gélose en boîte de Pétri contenant des colonies bactériennes, une fraction de chaque colonie est transférée sur le velours. En appliquant ensuite la surface du velours sur une autre gélose vierge, on obtient d'un seul coup un repiquage colonie par colonie de la première gélose, et, en répétant les « répliques », on peut repiquer l'ensemble des colonies d'une boîte de Petri sur de multiples boîtes.
   On peut démontrer par cette technique que les mutations surviennent indépendamment du facteur de sélection (figure 2). Pour cela on étale un grand nombre d'E.coli sur une gélose sans antibiotique. Lorsque la culture a poussé en donnant des colonies confluentes, on fait, à partir de cette gélose, des répliques sur d'autres boîtes contenant un antibiotique. Des colonies de mutants résistants à l'antibiotique apparaissent sur ces boîtes repiquées dont quelques unes occupent une position identique sur chaque boîte.
   On peut présumer que ceux-ci sont originaires de clones¹ de cellules résistantes qui se trouvaient sur la boîte d'origine.
   Un morceau de la surface de la culture est alors prélevé à l'emplacement correspondant sur la boîte d'origine et ensemencé dans un tube de bouillon. Lorsque la culture en bouillon s'est produite, un échantillon est étalé sur une seconde boîte de gélose sans antibiotique et, ensuite, lorsque cette culture a poussé, on repique par la technique du tampon de velours de nouvelles boîtes contenant l'antibiotique. On constate qu'il y a maintenant une plus grande proportion de colonies résistantes que la première fois. On constate aussi que des colonies de mutants résistants occupent une position identique sur chaque boite répliquée. Il suffit de prélever à nouveau un fragment de la surface de culture à l'emplacement correspondant sur la boîte d'origine et de porter ce fragment en bouillon.
   Si on répète ce processus plusieurs fois, on obtient des cultures de plus en plus riches en colonies résistantes à l'antibiotique. Finalement, en n'ensemençant que 100 cellules bactériennes, on obtient plusieurs colonies résistantes. On peut, sur la culture d'origine, les prélever séparément et vérifier qu'elles sont toutes composées de cellules bactériennes résistantes à l'antibiotiques.
   Le fait capital de cette expérience est que, sans aucun contact direct avec l'antibiotique, on a pu augmenter la proportion de mutants, à chaque cycle d'étalement, ce qui prouve que la mutation originelle conférent la résistance à l'antibiotique est apparue en l'absence de l'antibiotique qui ne joue dans l'expérience que le rôle d'agent sélecteur.

Discontinuité (caractère brusque)

La mutation ne s'effectue pas à la suite d'une longue période d'adaptation progressive, avec des formes intermédiaires, mais habituellement en une seule étape (loi du tout ou rien). Dans certains cas, cependant, un comportement extrême (par exemple résistance de haut niveau aux quinolones chez E.coli) apparaît à la suite de mutations successives de plusieurs gènes. On oppose cette résistance par étapes successives (« multiple step » resistance) à celle qui se produit en une seule étape (« one step » résistance).

Stabilité

Même en l'absence de l'agent sélecteur, le caractère acquis par la mutation est transmis à la descendance et se maintient dans les subcultures. La stabilité n'exclut cependant pas la réversibilité de la mutation (« reverse mutation »). Ex. : E.coli mutabile pour le caractère lactose.

Rareté

La mutation est un phénomène rare qui n'affecte qu'une faible fraction de l'ensemble des cellules bactériennes au sein d'une large population. La proportion des mutants que l'on peut observer dans la population bactérienne d'origine dépend de trois paramètres indépendants :

1. la probabilité qu'une cellule bactérienne mute dans une unité de temps donné, correspondant à un certain nombre de générations. Cette probabilité s'appelle le taux de mutation ;
2. la distribution dans le temps des évènements mutationnels durant la période de culture (cf. le test de fluctuation de Luria et Delbruck), des mutations très précoces produisant de très larges clones de descendants du mutant) ;
3. le taux de croissance du mutant comparé à celui du type parental sauvage (« fitness »).

Bien que rares, les mutants peuvent être sélectionnés au sein d'une population bactérienne, soit spontanément (sélection relative) parce qu'ils possèdent un avantage physiologique (ex : vitesse de croissance, taux de létalité, pathogénnicité...), soit artificiellement (sélection absolue) parce qu'ils sont par exemple résistants à un antibiotique qui « révèle » la mutation (agent sélecteur).

Indépendance et spécificité

La mutation n'affecte habituellement qu'un seul caractère en respectant les autres (ex. : M.tuberculosis sensible à tous les antibiotiques M.tuberculosis résistant à la streptomycine et sensible à tous les autres antibiotiques). Dans certains cas, lorsque les mutations résultent de la modification d'une séquence de gènes fonctionnant ensemble (un opéron), elles peuvent affecter plusieurs caractères (mutation pléiotrope).
La mutation d'un caractère donné ne modifie pas la probabilité de mutation d'un autre caractère. Il y a indépendance des mutations. Il en résulte que la probabilité de mutation simultanée à l'égard de deux caractères est égale au produit des probabilités individuelles. Si la probabilité de la résistance de M.tuberculosis à la streptomycine par mutation est de 10^-5 et celle de la résistance à l'isoniazide de 10^-6, la probabilité de résistance double simultanée à la streptomycine et à l'isoniazide est de 10^-11 (base de la polychimiothérapie de la tuberculose, du SIDA...).

2.1.2 La mutation à l'échelon moléculaire

Tout changement dans la séquence nucléotique d'un gène constitue une mutation. La séquence nucléotidique peut changer de deux manières, soit par substitution d'une paire de bases par une autre à la suite d'une erreur durant la réplication, soit par cassures de l'ossature sucre-phosphate de l'ADN avec perte, addition ou inversion d'ADN entre les deux cassures.

1. Changement de séquence consécutif à la substitution d'une paire de base : il peut s'agir d'une transition (ex. : AT est remplacé par GC), ou d'une inversion ou transversion (ATTA. La plupart des mutations par substitution d'une paire de bases sont réversibles (mutations réverses). Certaines sont silencieuses (inapparentes), en particulier quand la substitution concerne le 3^e nucléotide du codon car elles ne modifient pas la séquence en acides aminés de la protéine correspondante (dégénérescence du code génétique. D'autres sont au contraire létales, par exemple lorsque la mutation introduit un codon non-sens (protéine tronquée).
2. Changement de séquence consécutive à une cassure des liaisons sucre-phosphate : la mutation affecte en général une séquence de bases plutôt qu'une simple paire. Il y a délétion (perte) d'une séquence (codon) d'ADN, inversion d'une séquence, ou encore insertion d'une séquence. Dans ces cas, la mutation est souvent létale ou non réversible.